EL ADN EN ESTE PROYECTO

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A continuación se exponen los principios básicos genéticos desde los que se partió para comenzar el proyecto.

 

IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE

LOS RESTOS DE CRISTÓBAL COLÓN

 

1. INTRODUCCIÓN AL ANÁLISIS GENÉTICO

Pocos datos y no exentos de contradicciones se tienen sobre los orígenes de Cristóbal Colón, y mucho, pero también contradictorio, se sabe sobre los traslados después de su muerte.

Hay muchos restos de Colón y hay restos de su hermano (que no sabemos si es hermano de padre y madre, o sólo de padre o sólo de madre); en la práctica, lo más indubitado o conocido que parece existir son los restos de su hijo Fernando, ubicados en la Catedral de Sevilla.

Todo ello hace que sea estrictamente necesario estudiar toda la amplia gama de marcadores que existen, o sea, hacer todo tipo de análisis genéticos de identificación. Esto queda resumido del siguiente modo:

 

1.                          ADN AUTOSÓMICO: se hereda mitad de la madre y mitad del padre. Su estudio se basa en el análisis de STR (short tandem repeats) tras extracción del ADN y amplificación por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Paralelamente trataremos de analizar SNPs (single nucleotide polimorphysms) por medio de la técnica del SnaPshot, actualmente en desarrollo por parte de Applera.

Este ADN es imprescindible para identificar a Cristóbal porque su hijo tiene la mitad del ADN idéntica y también para ver si los huesos de la Catedral de Sevilla y los de Rep. Dominicana son de la misma persona.

2.                          ADN DEL CROMOSOMA “Y”: se hereda sólo por los varones procedentes del padre. Se estudiarán STRs y SNPs, con técnicas similares a las descritas para el ADN autosómico.

Este es un ADN necesario para establecer las relaciones padre-hijo (Cristóbal-Fernando), así como hermano-hermano de padre (Cristóbal-Diego). Del mismo modo sirve para corroborar o descartar hipótesis históricas.

 

3.                          ADN MITOCONDRIAL: se hereda por todas las personas procedente de su madre. Permite ver relaciones hermano-hermano de madre, y puede corroborar o descartar hipótesis históricas.

Su análisis se realiza por medio de secuenciación tras PCR. Se analizarán regiones tipo SNP ahora en desarrollo. También se puede considerar la clonación.

 

         Por lo tanto, todos los procesos de análisis consistirán en:

1.     Estudio antropológico de los huesos, con fotografías y video.

2.     Estudio radiográfico y por medio de TAC (si fuere necesario).

3.     Extracción del ADN por pulverización de fragmentos y extracción con técnicas diversas apropiadas según estado de cada uno de los fragmentos.

4.     Cuantificación del ADN por medio de slot-blot.

5.     Amplificación para:

a.      ADN autosómico

b.     Cromosoma Y

c.      ADN mitocondrial

6.     Análisis de fragmentos (electroforésis capilar)

7.     Secuenciación mitocondrial

8.     Análisis de SNPs (SNaPshot)

9.     Interpretación de resultados

10. Informes y conclusiones

 

2. ANÁLISIS DE ADN MITOCONDRIAL

Las mitocondrias son orgánulos con forma ovalada que están presentes en el interior de las células humanas, en un número variable. La mitocondria tiene una membrana externa y una interna muy plegada, que engloban una matriz fluida. En el orgánulo se desarrolla la fosforilación oxidativa, proceso productor de la energía celular. En la matriz, las moléculas orgánicas procedentes de la degradación de las materias alimenticias se oxidan en un serie de reacciones químicas llamadas ciclo del ácido cítrico. Los electrones obtenidos en dicho ciclo atraviesan una cadena de complejos enzimáticos respiratorios situados en la membrana interna, que dirigen la fosforilación del ADP en ATP que es la molécula portadora de la energía en la célula.

         Las mitocondrias, por ser probablemente descendientes de una bacteria “independiente”, poseen su propio material genético, el ADN mitocondrial (ADNmt) y la maquinaria para expresarlo, pero todo parece apuntar a que el ADNmt es, simplemente, un callejón evolutivo sin salida, una reliquia de la supuesta bacteria simbiótica. Habría que remontarse a unos 1500 millones de años para pensar en un acontecimiento crucial en la evolución orgánica, esto es, la absorción y posterior simbiosis (protección por oxigeno)entre una célula huésped (preucariotica) y una célula menor que había adquirido la capacidad de respirar. La respiración libera mucha mas energía que la fermentación anaeróbica y fue la creciente abundancia de oxígeno en la atmósfera la que acabo por consolidar una relación y posterior evolución que ha perdurado hasta nuestros días.

        Aunque las mitocondrias poseen su propio material genético, no son genéticamente autosuficientes ya que gran parte de sus proteínas funcionales y estructurales están codificadas por genes presentes en el núcleo celular.

 

ADN MITOCONDRIAL 

        El ADN nuclear está estrechamente asociado con proteínas y repartido en cromosomas, en cambio, el ADNmt se asemeja al ADN bacteriano en su forma de doble hélice circular.

        El ADNmt es un modelo de economía ya que sus genes están tan empaquetados que la mayor parte de los aproximadamente 16569 pares de bases (pb) que lo componen parecen tener alguna utilidad. La región codificante contiene 37 genes, de los cuales 22 son para ARN de transferencia, 2 para ARN ribosómicos y 13 para proteínas envueltas en la fosforilación oxidativa y en la producción de ATP

 

Esquema del ADNmt humano

El ADNmt humano fue completamente secuenciado en 1981 por Anderson y colaboradores y hoy se utiliza esa primera secuencia como referencia.

Las dos hebras complementarias o cadenas del ADNmt tienen diferencias significativas en la composición de las bases que conforman sus nucleótidos de manera que se denomina cadena pesada o H (Heavy) a aquella que es rica en bases púricas y cadena ligera o L (Light) a la que por el contrario posee un número mayor de bases pirimidínicas. Además de la región codificante, hay una región no codificante denominada región control y debido a las estructuras visibles bajo microscopia electrónica durante la replicación también es llamada asa de desdoblamiento (D-Loop).

La nomenclatura que se utiliza para nombrar la posición que ocupa cada nucleótido fue elegir arbitrariamente una posición intermedia en la región control y denominar a esta posición 1 y continuar en sentido 5’ a 3’ alrededor del circulo hasta la posición 16569 pares de bases.

La región control es responsable de la regulación de la molécula de ADNmt, tiene aproximadamente 1122 pares de bases de longitud y contiene los promotores de transcripción de ambas cadenas y el origen de replicación de la cadena pesada.

 La región control abarca desde la posición 16024 hasta la 16569 continuando desde la posición 1 hasta la 576.

 

 

 

 

 

Mapa del genoma mitocondrial humano y ampliación de la región control (Holland et al. Forensic Science Review. Vol 11 N. 1)

 

        A diferencia de lo que ocurre en las regiones codificantes del ADNmt, la región control tiene una alta variabilidad entre individuos, razón por la cual se ha convertido en objeto de análisis en estudios antropológicos e investigación en genética forense. 

Cuadro de texto: HV3

         Podemos dividir la región control en otras regiones en función de su grado de variabilidad. Por un lado las mas ampliamente estudiadas y conocidas por su alto grado de variabilidad; son la región hipervariable 1 (HV1) que abarca las posiciones 16024-16365 y la región hipervariable 2 (HV2) que va desde la posición 73 a la 340 (a veces se habla de una tercera región hipervariable: la HV3 entre las posiciones 440-560). Pero además existen otras regiones con un menor grado de variabilidad conocidas como región variable 1 (VR1) localizadas desde la posición 16366 hasta la 72 y región variable 2 (VR2) que esta comprendida entre las posiciones 341-576

 

      

 

 

Localización de regiones hipervariables, variables y Nº de pares de bases que las forman.

 

CARACTERÍSTICAS DEL ADNmT

El ADNmt tiene una serie de características que suponen una gran ventaja y que hacen de él una fuente de información importante en multitud de áreas de estudio. Estas características son las siguientes:

Herencia materna:

         La secuencia de una determinada molécula de ADNmt es llamada haplotipo, ya que el genoma mitocondrial es haploide, esto es debido a que en humanos, la herencia es estrictamente uniparental materna. Esto quiere decir, que salvo mutación, el ADNmt de hermanos, de hijos y madre y en general de aquellos individuos relacionados por vía materna es idéntico.

 

 

 

 

Representa la herencia materna del ADNmt. Considerando la figura cuadrada como un varón y la redonda como una mujer, se observa como una abuela trasmite su ADNmt a sus hijos (hermanos que tendrán idéntico ADNmt) y la hija de esta a su vez a sus hijos.

 

La explicación a la herencia materna es que las mitocondrias de los espermatozoides no contribuyen en la fertilización debido en primer lugar a que en sus cabezas hay solo unas pocas copias de ADNmt en comparación con los varios miles de copias de ADNmt del óvulo, pero además parece haber un mecanismo de reconocimiento específico que elimina las pocas mitocondrias paternas que pudieran introducirse en el óvulo. Por lo tanto y como consecuencia de lo anterior el ADNmt no esta sometido a procesos de recombinación.

 

Alto número de copias:

         Aunque el ADNmt contiene mucha menos información que el ADN nuclear, en cambio, tiene muchas mas copias por célula. Por término medio se estima que hay de 10-100 mitocondrias por célula y de 10-100 copias de ADNmt por mitocondria, lo que supone de 100-10000 copias de ADNmt por célula.

 

Alta tasa de Mutación y Heteroplasmia:

         El ADNmt tiene una tasa de mutación de 5-10 veces mayor que el ADN nuclear, esto puede ser explicado por una serie de factores entre los que cabe destacar el hecho que el ADNmt es muy sensible al daño oxidativo producido por los radicales libres liberados en la zona, además de que carece del efecto protector de las histonas (proteínas que si están presentes en el ADN nuclear). Por último, la baja fidelidad de la polimerasa del ADNmt y la aparente carencia de mecanismos de reparación colaboran con la alta tasa mutacional implicando una alta hipervariabilidad entre la población humana. Se ha estimado que entre 2 individuos caucasianos no relacionados por vía materna, hay una media de 8 diferencias en la secuencia de su ADNmt.

         Aún no esta clara cual es la tasa de mutación en el ADNmt (algunos autores hablan de 1/33 generaciones) pero a pesar de la herencia materna y de la ausencia de recombinación, lo cierto es que las mutaciones posibilitan que podamos encontrar una o más diferencias en la secuencia de ADNmt en la rama materna de una familia. Pero además si tenemos en cuenta que un individuo está formado por millones de células y que cada una de ellas puede contener miles de copias de ADNmt, en algunas ocasiones, un determinado individuo y por efecto de las mutaciones, puede presentar mas de un tipo de ADNmt. Este fenómeno es conocido como Heteroplasmia (para diferenciarlo del estado normal de Homoplasmia o de misma secuencia de ADNmt), esta coexistencia de dos o más poblaciones de ADNmt pueden ocurrir en una sola mitocondria, célula o individuo.

La heteroplasmia se puede dividir en heteroplasmia de secuencia: ocurre cuando en una posición determinada de la secuencia del ADNmt hay mas de una base, por ejemplo la existencia de C /T y heteroplasmia de longitud que se manifiesta como la variación en el número de bases existentes en un fragmento homopolimerico, por ejemplo es característica la variación en el número de C’s en el fragmento de poliC en HV2. Así, en un mismo individuo, pueden coexistir poblaciones de ADNmt las cuales difieren en el número de citosinas dentro de esos fragmentos.

Cuando una célula heteroplasmica se divide, la trasmisión de las mitocondrias a las células hijas se realiza al azar, resultando que la proporción de ADNmt mutante y normal, tras varios ciclos de división, puede derivar hacia el mutante o el normal en un proceso conocido como Segregación Replicativa. Esto hace que los niveles de heteroplasmia no siempre sean los mismos en los diferentes tejidos de un individuo.

 

APLICACIONES DEL ADNmt

Identificación humana:

         A pesar de la mayor información que puede aportar el estudio del ADN nuclear, en ocasiones su estudio es imposible cuando la muestra de la que se dispone es insuficiente o tiene excesiva degradación. Es en estos casos cuando el  ADNmt puede desplegar todo su potencial.

         Por tanto las muestras más idóneas para aplicar el análisis por ADNmt son aquellas que están en cantidad mínima y/o degradadas, destacando:

·        Pelos sin bulbo: un vestigio bastante común en pericia forense y que de hecho es posible obtener resultados a partir de una muestra tan pequeña como 1-2 cm de pelo carente de raíz.

·        Muestras muy degradadas como por ejemplo restos óseos antiguos. La estructura circular de la molécula de ADNmt hace que sea menos susceptible a la degradación por exonucleasas.

·        Análisis de restos de personas desaparecidas. Donde familiares relacionados por vía materna (incluso ascendientes o descendientes separados por alguna generación) pueden suministrar muestras de referencia que puedan compararse y verificar la identidad de los restos analizados. En este sentido el Programa FÉNIX de identificación de personas desaparecidas viene desarrollando esta labor desde 1998 y ha sido fruto de la colaboración entre el Departamento de Medicina Legal de la Universidad de Granada (España) y el Departamento de Análisis de la Dirección General de la Guardia Civil (España).

Estudios poblacionales y de diversidad humana:

         Muchas de las características que sirven de base en identificación humana, pueden aplicarse aquí también. La región control del ADNmt es usada para estudios de evolución humana, origen de poblaciones, estudios filogenéticos.

Identificación de especies no humanas:

         El análisis de ADNmt puede también ser usado para análisis de identificación de especies estudiando zonas como el extremo 5’ del gen del Citocromo b.

 

PROCEDIMIENTO ANALÍTICO.

El análisis de ADNmt, es de los análisis forenses, el mas costoso, no-solo a nivel económico sino de tiempo y esfuerzo, ya que por un lado se aplican multitud de técnicas de biología molecular para obtener un resultado y porque las muestras suelen ser degradadas y/o mínimas, requiriendo muchas reacciones y procedimientos de control.

            El esquema básico del proceso analítico sería el siguiente:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Esquema resumen del procedimiento analítico en ADNmt

 

 

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

         En muestras como hueso y diente es necesario una etapa de limpieza previa. Este proceso se realiza lijando la superficie externa de estas muestras con objeto de eliminar los restos que están adheridos a la superficie. Esto se puede conseguir mediante un procedimiento manual con una lima o con alguna herramienta como la Dremel. Posteriormente y una vez limpiada la muestra se procede a tomar una porción para pulverizarla, este proceso puede realizarse como se ha descrito e incluso con equipos mas sofisticados como el Freezer Mill (que utiliza Nitrógeno líquido).

         Puede ser de utilidad una cabina de extracción de hueso que consta de los siguientes elementos:

Esta cabina por un lado evita la obstrucción de los filtros de las cabinas de flujo laminar empleadas en la preparación de muestras como huesos, etc. con el posible peligro de contaminación, sino que además facilita la tarea de limpieza de todo el equipamiento ya que se reduce el espacio donde se manipula la muestra.

 

EXTRACCIÓN DEL ADN

Hay distintos métodos de extracción en función de:

TIPO DE MUESTRA (sangre, pelos, saliva, semen, etc...)

ESTADO DE LA MUESTRA (en buen estado ó degradada)

CANTIDAD DE MUESTRA (indicios mínimos, o cantidad suficiente)

Tiene como objetivo, liberar el ADN del interior del núcleo de la célula. Sirva como ejemplo el proceso de extracción de ADN a partir de hueso.

 

 

 

 

 

Esquema resumen del proceso de extracción de AND a partir de hueso       

 

 

AMPLIFICACIÓN DEL ADNMT.

Las bases teóricas de la reacción de PCR son simples. En la reacción intervienen tres segmentos de ADN: el segmento de doble cadena que queremos amplificar, y dos pequeños fragmentos de cadena sencilla, los oligonucleótidos (primers u oligos), que tienen la misma secuencia que los extremos flanqueantes del ADN molde. Además, participan en la reacción el enzima Taq polimerasa (Taq), deoxinucleótidos-trifosfato (dNTPs), sales, y un tampón.

Los oligos se añaden a la reacción en exceso con respecto al ADN que desea amplificarse. Los oligos hibridarán con las regiones complementarias del ADN, quedando orientados con sus extremos 3´ enfrentados, de modo que la síntesis mediante la ADN polimerasa (que cataliza el crecimiento de nuevas cadenas 5´® 3´) se extiende a lo largo del segmento de ADN que queda entre ellas.

El primer ciclo de síntesis producirá nuevas cadenas, de longitud indeterminada, las cuales, a su vez, son capaces de hibridar con los oligos. Este tipo de productos se irá acumulando de forma geométrica, con cada ciclo de síntesis, utilizando como moldes las moléculas de ADN parental de la reacción.

Durante el segundo ciclo de síntesis, estas cadenas hijas servirán a su vez como moldes, generándose en este caso fragmentos cuyo tamaño será el del fragmento que engloba los extremos de ambos oligos. Estas nuevas cadenas hijas servirán de molde a su vez para sucesivos ciclos de síntesis. La cantidad de estos productos se duplica con cada ciclo, por lo que se van acumulado de forma exponencial. Al cabo de 30 ciclos, habrán aparecido 270 millones de estas moléculas, por cada una de ADN original que hubiese.

El primer paso necesario en este proceso de la síntesis es la desnaturalización del ADN. Puesto que el molde es una molécula de ADN de doble cadena, será necesaria la separación de estas para que los oligos puedan acceder a sus secuencias complementarias y unirse a ellas en el siguiente paso, llamado de alineamiento ("annealing"). Una vez que los oligos se han unido a las cadenas, sirven como cebadores para la acción de la ADN polimerasa, la cual comienza a crear a partir de ellos nuevas cadenas de ADN complementarias, en el proceso de elongación. Estos tres pasos consecutivos (desnaturalización, alineamiento y elongación) constituyen un ciclo de síntesis.

Para las reacciones de PCR de secuenciación se ha diseñado una Taq polimerasa especifica, Taq FS (fluorescente sequencing), a partir de la Taq polimerasa de Thermus aquaticus y modificada genéticamente de forma que posee muy baja actividad exonucleasa 5´->3´ con lo que los resultados son más limpios con menos ruido de fondo y apenas falsas terminaciones. Además este enzima incorpora los ddNTPs marcados fluorescentemente más eficientemnte, con lo cual son necesarios menos ddNTPs-fluorescentes y menos ADN molde para conseguir la misma señal.

En los últimos años, también se ha avanzado notablemente en la obtención de sondas fluorescentes cuyos espectros de emisión de fluorescencia presentan un mínimo solapamiento

Como se ha indicado anteriormente, son las regiones hipervariables (HV1 y HV2), dentro de la región control, las zonas de especial interés con fines de identificación humana. Son varias las estrategias que se siguen para realizar la amplificación por PCR de estas zonas estando en función de dos variables:

Cuando las muestras son frescas y están en buenas condiciones es posible realizar una amplificación de la región control completa (1122 pb), para ello basta con utilizar los primers adecuados. No obstante si la muestra esta degradada o se sospecha la escasa cantidad de ADN que pueda contener se van reduciendo los fragmentos a amplificar llegando, en los casos más extremos, a ir amplificando regiones de unos 100 pares de bases.

Hay un hecho que llama poderosamente la atención y es la cantidad de parejas de primers que se utilizan hoy en día para la amplificar por PCR y como no hay aún unanimidad en la nomenclatura que se sigue para nombrarlos. Algunos autores los nombran como F o R (en función de que amplifiquen o secuencien en dirección Forward o Reverse) otros en cambio utilizan una nomenclatura que alude a la cadena donde hibridan, así se denominan L o H (de Light o Heavy). Otro diferencia radica en nombrar la base (siguiendo la secuencia de Anderson) donde terminan o empiezan a hibridar los primers es decir en función de su extremo 3’ o 5’. En cualquier caso de estas nomenclaturas no se puede deducir la secuencia de los primers.

 

PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR.

         Tiene por objeto eliminar los dNTPs y primers que no se han utilizado en la reacción de PCR y que podrían interferir en la reacción de secuenciación.

Hay distintos métodos para realizar esta operación, pero uno de los mas empleados es el que usa los filtros Microcon 100.

 

SECUENCIACIÓN DEL ADNmT

         Tiene por objeto determinar el orden de nucleótidos que componen el fragmento de ADNmt a estudiar.

Hay varios métodos para secuenciar, pero él mas extendido es el método que emplea los dideoxinucleótidos como terminadores de cadena, también llamado método de Sanger, que es utilizado para la secuenciación cíclica del ADNmt.

La clave en este método esta en la utilización de nucleótidos modificados llamados dideoxinucleótidos (ddNTPs). Estos son idénticos a los nucleótidos normales o deoxinucleótidos (dNTPs) utilizados durante la síntesis del ADN, exceptuando la falta de un grupo OH en la posición 3’ de la molécula de desoxirribosa.

 

 

 

 
 

Esquema de un nucleótido normal (izquierda) y de un dideoxinucleótido o terminador (derecha)

 

Durante la síntesis del ADN, un dideoxinucleótido puede ser añadido a la cadena de ADN en crecimiento, pero debido a la falta del grupo OH, el siguiente nucleótido no podrá incorporarse. Por esta razón a los dideoxinucleótidos se les llama también terminadores.

La secuenciación cíclica es el nombre dado al proceso que utiliza sucesivos ciclos de desnaturalización, hibridación de primer, y polimerización para formar grandes cantidades de producto en una única reacción de secuenciación. Este proceso de amplificación (similar a una PCR), utiliza un único primer, incrementándose linealmente el producto de ADN con el número de ciclos. (Se distingue de una reacción de PCR en que esta utiliza dos primers, de manera que la cantidad de producto se incrementa exponencialmente con el número de ciclos)                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                           

          

 

 

Secuenciación cíclica. Automated DNA sequencing PE Applied Biosystems.

 

 

Los ddNTPs pueden ser marcados fluorescentemente y mezclarse con nucleótidos normales, un primer, y el ADN. Durante la reacción los ddNTPs compiten con los dNTPs por las posiciones en el ADN, resultando un conjunto de fragmentos que difieren en una única base en longitud. Al final de cada cadena o fragmento hay una molécula marcada fluorescentemente con un color que depende de la base que haya en esa posición terminal. Los colores son utilizados en este caso como método para determinar la secuencia ya que el producto de secuenciación puede ser incorporado a equipos automatizados que por un lado separan los fragmentos por tamaño y por otro lado son capaces de detectar la fluorescencia que emiten los fluorocromos cuando son excitados por un láser.

          Algo que hemos aprendido con la secuenciación  del genoma humano es que el ADN está compuesto por pequeñas pero importantes variaciones genéticas. Los humanos son un 99.9% identicos, es decir, cualquiera de los dos cromosomas diferiran en una proporción de aproximadamente una entre 1250 letras del código genético. La mayoría de nosotros no somos gemelos identicos  y no somos clones unos de otros. Así que ¿cómo explicar las diferencias?, ¿Porqué algunos tienen cancer ó diabetes y otros no?. El ambiente y el estilo de vida ciertamente juegan un papel importante. Para contestar todas estas preguntas son de vital importancia  las variaciones geneticas. La mayor parte de estas variaciones son los SNPs (Single Nucleotide Polymorphismos) y ocurre uno cada 100 ó 300 bases. Un aspecto clave de la identificación en genética es la sociación de las variaciones de las secuencias con fenotipos hereditarios. Es de esperar que los SNPs aceleran la identificación forense de personas y la identificación de enfermedades genéticas sí conseguimos asociar la enfermedad con diferentes SNPs en la población. Así pues, el destacado progreso de las tecnologías de los SNPs, impactaran profundamente en la ciencia forense gracias a la gran disponibilidad de SNPs y polimorfismos de inserción/deleción (DIPs).

         Los SNPs son una valiosa herramienta para la localización e identificación de genes que producen enfermedades, la comprensión de mecanismos moleculares de las mutaciones y la deducción del origen de las poblaciones humanas modernas.

         Los métodos para estudiar los SNPs pueden dividirse en tres clases:

1-     Métodos tales como SSCP ó HPLC, que se basan en las propiedades fisico-químicas de los alelos.

 2-     Métodos tales como TAQMAN que se basan en la hibridación, amplificación y unión a sondas específicas de un alelo.

3-     Métodos basados en la extensión ó minisecuenciación de alelos específicos desde el primer adyacente hasta el SNP, este es el llamado método del SnaPshot.

 

PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO DE SECUENCIACIÓN.

         Tiene como objeto, eliminar los terminadores no incorporados y que de no eliminarlos convenientemente podrían enmascarar la secuencia de ADN obtenida complicando así la interpretación de los resultados.

Purificación del producto secuenciado mediante la precipitación con etanol (método de elección cuando se usa el kit de Big Dye V.3.0 de Applied Biosystems).

Hay que tener en cuenta que durante la fase de precipitación los ddNTPs se encuentran en el etanol. Por lo que hay que eliminar todo el etanol sin evaporarlo. El etanol absoluto ha de ser de calidad y recién abierto.

         Antes de colocar las muestras en el equipo que las analizará (como ejemplo ABI PRISM 310) hay que prepararlas convenientemente, hidratando la muestra con TSR (Template Suppresion Reagent).

 

ELECTROFORESIS.

La electroforesis capilar es una técnica relativamente novedosa en el campo de la Genética Forense pero que está poco a poco sustituyendo a los sistemas de electroforesis vertical. En este caso el  proceso electroforético es llevado a cabo en un capilar de silica de unas 50 mm de diámetro, lo cual hace que la cantidad de calor generado sea menor y que puedan aplicarse voltajes mayores. Para que puedan ser analizados por electroforesis capilar los primers o los dideoxinucleótidos (en el caso de la secuenciación) deben ser marcados fluorescentemente con unas moléculas denominadas fluorocromos que emiten fluorescencia a una determinada longitud de onda cuando son excitados por láser. El equipo en el que se realiza el proceso lleva acoplado un ordenador encargado de traducir los datos de emisiones fluorescentes en secuencias o fragmentos con sus correspondientes alelos asignados.

 

ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS.

         Una vez analizadas las muestras en el equipo, es necesario ver los resultados obtenidos bajo el software Séquense Navigator (p.ej.) que nos va a permitir no solo editar la secuencia (en algunas posiciones el ordenador interpreta mal o no sabe como interpretar) sino también comparar nuestra secuencia con la secuencia de referencia (secuencia de Anderson) para mostrar las diferencias existentes.

Por tanto finalizada la fase de lectura, antes de ser analizados, a los datos se les aplica un filtro matemático que corrige cualquier solapamiento de los espectros de emisión ya que, aunque los terminadores presentan máximos de emisión a difererentes longitudes de onda, los espectros se solapan en cierta medida.

        El software utilizado procesa automáticamente los datos recogidos en una secuencia de bases, los analiza y los visualiza en el monitor.

 

 

 

 

GUÍA DE INTERPRETACIÓN.

Cuando se observan diferencias entre la secuencia de referencia y la secuencia de una muestra, solo se tiene en cuenta la posición y el nucleótido que difiere. Por ejemplo Anderson describió que en la posición 263 (HV2) había una A, sin embargo, es frecuente que haya un cambio de esa A por una G, por tanto será nombrada esa diferencia como 263G. Las diferencias no son solo cambios de nucleótidos, también hay inserciones (se denominan colocando la posición seguida de un punto y de un número que alude a las inserciones producidas, ejemplo 309.1C (una inserción de ese nucleótido en la posición 309), 309.2C (si son 2 las citosinas) y así sucesivamente) también hay delecciones (se denominan colocando la posición seguida de una “d”, ejemplo 16240d). Cuando en una determinada posición no se sabe que nucleótido es el que la ocupa se coloca una “N”, ejemplo 16345N. En otras ocasiones y debido a las heteroplasmias de secuencia se puede observar que en una determinada posición hay una mezcla de 2 nucleótidos y en estos casos se debe de seguir el código IUPAC, por ejemplo una mezcla de A/G se denomina como R, ejemplo 16110R. También podría ocurrir que no hubiese ninguna diferencia con respecto a la secuencia de referencia.

         Cuando se comparan dos muestras como por ejemplo una muestra de referencia y un indicio o se comparan dos individuos, se observarán los resultados finales obtenidos y si hay 2 o más nucleótidos de diferencia se concluye que la muestra de referencia y el indicio son diferentes o que no hay relación por vía materna entre dos individuos analizados. No obstante, cuando no hay diferencias en la secuencia entre muestras se puede decir que no se pueden excluir la relación existente entre ambas.

         Hoy en día se están generando bases de datos de ADNmt que poseen datos relativos a las secuencias analizadas (concretamente a las diferencias encontradas entre cada muestra con la secuencia de referencia), y se están haciendo grandes esfuerzos para que engloben el mayor número posible de secuencias y así poder realizar un abordaje estadístico que permitan establecer el cálculo de las frecuencias que unas determinadas secuencias tienen en la población.

 

3. CROMOSOMA Y

      De los 23 pares de cromosomas que componen el genoma humano, 22 son los denominados autosomas y el par 23 constituye los que se denominan cromosomas sexuales. En la especie humana los cromosomas responsables del sexo son 2: el cromosoma X y el cromosoma Y (ver fotografía), de manera que el sexo femenino viene representado por dos cromosomas X (XX) y el masculino por un cromosoma X y otro Y

        Esto se debe a que tras la fecundación la mitad del ADN del cigoto procede del óvulo materno (que porta un cromosoma X) y la otra mitad del procede del ADN del espermatozoide (que puede portar un cromosoma X o un cromosoma Y), por lo tanto, es el espermatozoide el que determina el sexo del futuro individuo.

        El cromosoma Y representa solamente el 2% del genoma humano, es uno de los cromosomas más pequeños, con un tamaño aproximado de 60 Mb. El 95% del cromosoma Y no recombina (no intercambia material genético) con el cromosoma X , por lo que se transmite de manera intacta de padre a hijo. Esta característica hace que a través del cromosoma Y puedan estudiarse linajes paternos.

        El cromosoma Y posee funciones biológica importantes relacionadas básicamente con la determinación testicular y la fertilidad masculina.

    Aunque la mayor parte de este cromosoma está constituido por ADN que no se expresa (ADN no codificante), existen unos cuantos genes de importancia funcional.

    Dentro del cromosoma Y podemos diferenciar tres regiones:

-         Dos regiones pseudoautosómicas, que se denominan así porque en estas regiones del cromosoma Y se produce durante la meiosis un intercambio de material genético con el cromosoma X, por lo que la herencia de estas regiones es idéntica a la del resto de cromosomas denominados autosomas.

-         Una región específica del cromosoma Y y que se denomina región no recombinante. Esta región no intercambia material genético con el cromosoma Y y, por lo tanto se transmite íntegra de padre a hijo.

 

Polimorfismos del Cromosoma Y: Microsatélites 

        Al igual que en los autosomas, los microsatélites del cromosoma Y son secuencias constituidas por la repetición en tándem un determinado número de veces de una secuencia consenso o unidad.

        Por tanto, el polimorfismo o variación entre individuos depende del número de repeticiones. La única diferencia es que en este caso sólo tendríamos una copia o alelo de cada marcador ya que, como hemos dicho antes son marcadores que se encuentran en la región no recombinante que es específica del cromosoma Y, del cual sólo hay una copia por individuo.

        La falta de recombinación determina que todas las secuencias ubicadas en esta zona se hereden como un bloque, constituyendo un grupo de ligamiento.

        Al conjunto de alelos obtenidos tras el análisis de una serie de marcadores de este tipo se denomina haplotipo.

        Dentro de los marcadores polimorficos del cromosoma Y, los microsatélites son los más utilizados ya que tienen un alto grado de polimorfismo dentro de la población y son fácilmente analizables por PCR

        En la tabla se muestra el nombre de los nueve microsatélites más utilizados en Genética Forense y sus secuencias consenso o unidad.

 

Marcadores

Secuencia unidad

DYS385

GAAA

DYS388

ATT

DYS389 I

DYS389 II

(TCTG) (TCTA)

(TCTG) (TCTA)

DYS390

(TCTA) (TCTG)

DYS391

TCTA

DYS392

TAT

DYS393

AGAT

YCAIII

CA

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

        Gracias al gran avance sufrido en las técnicas de análisis genético en los últimos años, el estudio del cromosoma Y ha revelado una gran cantidad de polimorfismos de gran utilidad en:

         - El estudio del origen y evolución de las poblaciones

         - Estudios de paternidad

- Aplicaciones forenses, tanto en la resolución de casos de criminalística como en casos de identificaciones humanas.

 

Investigación Biológica de la Paternidad

        El estudio de los microsatélites del cromosoma Y es de gran utilidad en el caso de paternidades rutinarias (en las que se dispone de madre, padre e hijo) pero más aún en casos especiales en los que se carece de muestra del presunto padre pero si hay un hermano varón o cualquier familiar varón por parte del padre (ver esquema).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

        Explicación esquema: Se representa el tipo de herencia que siguen los marcadores microsatélites utilizados en los estudios de paternidad. Como en todo pedigrí un círculo es representativo de una hembra y un cuadrado de un varón.

        Como los marcadores que utilizamos en los estudios de paternidad están en la zona no recombinante del cromosoma Y, éstos se heredan intactos (salvo mutaciones) por vía paterna. Así, según el esquema los hijos varones de la 2ª generación (hermanos entre si) serán idénticos en cuanto a los marcadores analizados, pasará lo mismo con los hijos varones de la 3ª generación (que son primos hermanos de padre) y así sucesivamente.

        Por lo tanto podremos comparar ADN de cromosoma Y en los siguientes casos:

-         Padre-hijo

-         Hermano-Hermano

-         Tío paterno-sobrino

-         Primos hermanos paternos

-         Abuelo Paterno-nieto

        Como vemos, los polimorfismos del cromosoma Y pueden proporcionar información adicional en casos de investigación biológica de paternidad en hijos varones cuando, por fallecimiento del progenitor u otras causas, no estén disponibles datos genéticos relativos al presunto padre, ya que dicha falta puede suplirse con los datos de familiares varones por línea paterna.

        Es muy importante señalar que el estudio de estos polimorfismos debe ser complementario al de marcadores autosómicos, ya que una inclusión de paternidad basada sólo en cromosoma Y no tendría validez, puesto que tampoco de excluirían como presuntos padres a todos los familiares por vía paterna del supuesto padre (un hermano, sobrino, primo, etc.).   

        Si tienen un mayor grado de validez y fiabilidad estos marcadores en las confirmaciones de exclusión, siempre y cuando se analicen un número suficiente de los mismos. 

        Otra limitación que plantea al análisis de polimorfismos del cromosoma Y es que su utilidad queda reducida a aquellos casos en los que el hijo sea un varón.

 

Casos de Identificación Genética

        Otra de las grandes aplicaciones de los STRs del cromosoma Y es la identificación de restos óseos, sobre todo si se trata de restos antiguos de los que no se tienen familiares de generaciones cercanas para comparar (un hijo, hermano, etc.). En estos casos el uso de STRs autosómicos queda muy limitado ya que, conforme aumenta el número de generaciones las posibilidades de establecer relaciones de parentesco entre el ancestro y los descendientes actuales cada vez se complican más, llegando un momento en el que esto se hace imposible.

        En los casos de Identificación genética de restos óseos podemos encontrarnos una gran variedad de situaciones que deben ser resueltas de maneras diferentes.

        La resolución del caso va a depender fundamentalmente de dos parámetros que son la data y el estado de conservación de los restos. Ambos parámetros van estrechamente ligados ya que, si bien es importante la edad o data del resto óseo aún lo son más las condiciones de conservación a las que se haya encontrado sometido. Normalmente las posibilidades de conseguir un ADN de buena calidad y en suficiente cantidad son mayores en restos óseos recientes que en restos antiguos, pero si un resto óseo reciente ha estado sometido a un calor o humedad excesivos puede ser que el ADN esté seriamente dañado y que el análisis del mismo se complique enormemente.

        En este sentido, uno de los desafíos actuales de la Genética Forense, es la identificación de restos óseos de interés histórico.

 

4. ADN AUTOSÓMICO

        Dentro del ADN nuclear solamente una pequeña parte va a dar lugar a proteínas fundamentales para el organismo, el resto está constituido por  lo que se denomina ADN  no codificante el cual supone más del 90% del ADN nuclear. El ADN no codificante ha sido denominado también ADN basura debido a que por ahora no se le asocia función alguna, no obstante, este ADN es una herramienta esencial para la investigación forense.

        De los diferentes tipos de secuencias de ADN no codificante que existen son las secuencias repetidas en tándem las más usadas para la identificación genética. Estas secuencias suponen el 5 - 10 % del genoma de los mamíferos y, generalmente, se caracterizan por la presencia de una secuencia común repetida en tándem de manera continua en un fragmento de ADN.

        Son características de los centrómeros y de los telómeros y parece que son importantes para determinar la estabilidad y la posición correcta de los cromosomas.

        A continuación se muestra un esquema con los tres principales tipos de secuencias repetidas en tándem:

 

REPETICIONES EN TANDEM

 

Grado de repetición (por locus)

Numero de loci

Longitud de la     secuencia consenso

SATELITES

103-107

1-2 por cromosoma

1-varios miles de pares de bases

MINISATELITES

10-103

Varios miles por cromosoma

9-100 pb

MICROSATELITES

10-102

>105 por genoma

1-6 pb

 

 

 

 

 

 

 

 

De los tres tipos de secuencias repetidas en tándem  son los minisatélites y, sobre todo, los microsatélites, los que se utilizan en la identificación genética. Esto se debe a que al ser la longitud de la secuencia consenso menor (ver tabla) el análisis es mucho más simple y, además, la probabilidad de que estos fragmentos se encuentren en buenas condiciones es mayor. Esto último es de gran importancia en Genética Forense, sobre todo en el análisis de restos óseos antiguos ya que en la mayoría de los casos han estado sometido a condiciones de humedad y calor, lo cual favorece el crecimiento de bacterias que tienen la facultad de degradar (“romper”) el ADN en fragmentos pequeños. Por lo tanto, cuanto menores sean los fragmentos que vamos a analizar menor será la probabilidad de que éstos se encuentren degradados y mayor la probabilidad de poder obtener un resultado positivo.

 

Minisatélites

Son secuencias de ADN constituidas por una secuencia consenso de 9 a 100 pb repetida en tándem.

        Los minisatélites suelen encontrarse cerca de los telómeros, aunque también se han encontrado intercalados en otras posiciones cromosómicas.

        Estas secuencias de ADN son altamente polimórficas o variables entre los distintos individuos.

        La variabilidad entre individuos se basa en el número de veces que se repite una determinada secuencia consenso.

En el caso de las secuencias tipo minisatélite, en las que la longitud de la secuencia consenso puede variar entre 9 y 100 pares de bases, a las variaciones en el número de repeticiones (o polimorfismo) se les denomina abreviadamente VNTR (Variable Number of Tandem Repeat o Número Variable de Repeticiones en Tándem).

 

Microsatélites

Los loci microsatélites son los de mayor utilidad hoy en día en el campo de la identificación genética. Son bastante abundantes, cada 6-10 Kb del genoma humano puede encontrarse una secuencia de este tipo. Los STR se distribuyen ampliamente por todo el genoma encontrándose tanto en regiones génicas (codificantes) como extragénicas (no codificantes). Los STR situados en regiones extragénicas o no codificantes son los responsables del gran avance de la Genética Forense

Contienen una secuencia consenso de 1 a 6 pb repetida en tándem. Al igual que los minisatélites son secuencias altamente polimórficas y en este caso a los polimorfismos de estas secuencias se les llama STR (Short Tandem Repeat o repeticiones cortas en tándem).

Las repeticiones de trinucleótidos o tetranucleótidos (3 y 4 pb) poseen un alto grado de polimorfismo, lo cual, junto a su pequeño tamaño, hace que sean muy utilizados como marcadores de identificación genética.

        Actualmente los polimorfismos tipo STR son fácilmente analizables gracias a la técnica denominada PCR (Polymerase Chain Reaction o reacción en cadena de la polimerasa). Las ventajas básicas que ofrece la PCR frente a otras técnicas utilizadas con anterioridad son las siguientes:

1.     Su capacidad para obtener resultados en casos de muestras mínimas y/o degradadas

2.     Genera en poco tiempo un elevado número de copias del fragmento de ADN objeto de estudio.

       Los marcadores más utilizados actualmente en identificación genética son los microsatélites debido principalmente a su pequeño tamaño y a su elevado grado de polimorfismo.

        El análisis de un determinado número de estos marcadores permite obtener un perfil genético prácticamente único para cada individuo y además, establecer relaciones de parentesco ya que los microsatélites siguen un patrón de herencia mendeliano.

        La complejidad del análisis como la calidad de los resultados en estos casos va a depender de varios factores:

-         Cantidad de ADN: esto dependerá del número de células nucleadas que contenga la muestra biológica analizada. En el caso de restos óseos , sobre todo si las condiciones de conservación no han sido las adecuadas, la probabilidad de encontrar células con núcleo es bastante pequeña.

-         Calidad del ADN: Si el ADN está altamente degradado o contaminado puede llegar a no ser útil para el estudio de identificación o presentar serias dificultades para la obtención de resultados. Esto va a depender, como se apuntó anteriormente, al estado de conservación de los restos.

-         Las técnicas utilizadas: en la mayoría de los casos de identificación a partir de restos óseos antiguos el ADN es escaso y se encuentra parcial o totalmente degradado. Por ello es importante disponer de la mejor y más moderna tecnología. Los sistemas actuales de amplificación y posterior detección en equipos de electroforesis capilar, permiten la obtención de resultados a partir de cantidades mínimas de ADN (entre 0.5 y 1 ng) y fragmentos de tamaños en torno a los 200 pares de bases.

El análisis de los loci STR para su aplicación en identificación genética humana se ha simplificado enormemente gracias a la posibilidad de amplificar conjuntamente dos o más loci en una única reacción (multiplex-PCR). Los sistemas de amplificación multiplex ofrecen una serie de ventajas sobre los sistemas individuales:

 

-     Disminuyen el tiempo de análisis

-     Aumentan el poder de discriminación del sistema

-     La cantidad de ADN que se requiere es menor

-     Disminuyen la cantidad de reactivos con lo que se abarata el coste total del análisis.

    Los productos de amplificación pueden ser separados en función de su tamaño mediante una técnica rutinaria en los laboratorios de Genética Forense, la electroforesis.  Mediante esta técnica los fragmentos de ADN amplificado migran a través de un soporte, que suele ser de agarosa o de acrilamida, cuando son sometidos a la acción de un campo eléctrico.  Los sistemas convencionales de electroforesis utilizan como soporte geles desnaturalizantes de poliacrilamida y la detección de los fragmentos separados se hace de manera manual mediante tinción de los geles con nitrato de plata.

         La electroforesis capilar (normalmente representada por su acrónimo en inglés, CE) es un método alternativo para la separación de fragmentos y obtención de secuencias de ADN que suple, en parte, los inconvenientes de los sistemas convencionales. En este caso el soporte o medio de separación es un polímero incluido en un capilar de silica de unos 50mm y de longitud variable lo cual hace que la cantidad de calor generado sea menor y que puedan aplicarse voltajes mayores. La gran ventaja en cuanto a rapidez de la técnica se debe a que la preparación del gel y la carga de muestras se hacen de manera automática. Por otro lado se consigue una mayor sensibilidad, al poderse obtener resultados interpretables en los casos en los que el número de copias obtenidas por PCR es bastante bajo, y aumenta la capacidad para diferenciar alelos que se distinguen en un par de bases. Además, los resultados obtenidos son analizados por un software evitándose así problemas de interpretación y permitiendo que éstos queden almacenados para posibles futuros análisis.

 

 

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