Bateria de Pruebas Bioquímicas
Batería de Pruebas Bioquímicas
Aquí están algunas de las Pruebas Bioquímicas más frecuentes:

· Fermentación de la lactosa (Mc Conkey) · Agar Hierro de Kliger (KIA) · Prueba del Indol · Citrato de Simmons · Agar Hierro Lisina (LIA) · Agar Urea de Christiansens · Prueba de la Fenilalanina (PPA) · Reducción de los Nitratos · Movilidad · RM - VP · Oxidasa y Catalasa

Fermentación de la lactosa (Mc Conkey)
El agar Mc Conkey es un medio sólido, diferencial y selectivo. Se usa para la discriminación de bacterias con capacidad de fermentar la lactosa (Lac + y -).Composición g/l :

- Peptona 20.0 : fuente de nitrógeno y carbono para las Lac -.

- Lactosa 10.0 : fuente de carbono para las Lac +.

- Sales biliares 2.5 : le confiere carácter selectivo, inhibiendo el crecimiento de Gram +.

- Cloruro sódico 5.0 : para mantener la tonicidad del medio (evitar osmosis).

- Rojo neutro 0.05 : indicador que va hacer que el medio vire de coloración. Si las bacterias son Lac +, producirán ácidos derivados de la fermentación que darán al medio un aspecto rosáceo; si por el contrario son Lac -, el medio se basificará por el uso de la peptona y se tornará amarillo.

- Cristal violeta 0.001 : interfiere junto con las sales biliares en la selectividad del medio.

- Agar-agar 15.0: da consistencia al medio.

Lac +        Lac -

Agar Hierro de Kliger (KIA)
El agar Hierro de Kliger (KIA), es un medio sólido y diferencial. El fundamento se basa en la capacidad de fermentación de dos azucares (glucosa y lactosa), en la producción de ác. sulfhídrico y en la producción de gas. Composicion g/l:
Extracto de carne 3.0 Extracto de levadura 3.0
Peptona 20.0 Lactosa 10.0
Glucosa 1.0 Cloruro sódico 5.0
Citrato férrico amónico 0.5 Tiosulfato sódico 0.5 : fuente de azufre, las bacterias lo reducen produciendo ác. sulfhídrico (precipitado negro)
Rojo de fenol 0.03 : indicador, si vira a rosáceo , indica basicidad del medio, si es amarillo indica acidificación (derivada de ác. de la fermentación)

Interpretación del Kliger:

NC o SC: no cambio o sin cambio LC, Alk o K : alcalinidad
H2S o subíndice s: si produce ác. sulfhídrico G: productora de gas
Ejemplo: A/As indica que es fermentador de glucosa, lactosa y productor de sulfhídrico
1 Fermentador glucosa, productor ác. sulfhídrico y de gas.
2
3 Fermentador glucosa, lactosa y productor de gas.

Prueba del Indol
Pone de manifiesto la presencia de la encima Triptofanasa en nuestras bacterias, si esta presente degradará el triptofano y liberará al medio Indol, para revelar su presencia usaremos el reactivo de Kovac; si hay indol se formará un anillo rojo en la superficie, sino este será amarillo. Para esto sembramos en caldo con triptofano.
Indol+ Indol-

Citrato de Simmons
Cit + Cit -
  Se usa para determinar si el organismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono y compuesto amoniacales como única fuente de nitrógeno. El medio contiene citrato sódico, fosfato de amonio y azul de bromotimol como indicador; este se tornará azul cuando el medio se basifica. Las bacterias que metabolizan el citrato liberan iones amonio al medio (degradación del fosfato amónico) lo que provoca que este se alcalinice y el indicador vire azul.
Agar Hierro Lisina (LIA)
Este medio pone de manifiesto:

- Si la bacteria posee la enzima descarboxilasa (LDC). el medio contiene como indicador Purpura de Bromocresol, cuando la lisina se descarboxila, el medio se acidifica y el indicador vira amarillo en el fondo.

- Si es productora de ác. sulfhídrico, en cuyo caso el precipitado negro nos impedirá ver si es LDC + o -.

- Si es productora de gas.

1. LDC -, NO H2S, PRODUCTORA GAS.
2. LDC + ó -, PRODUCTROA H2S Y GAS.
3. LDC - , NO H2S, PRODUCTORA DE GAS

Agar Urea de Christensen
Urea - Urea +
  Pone de manifiesto la actividad de la enzima ureasa, para degradar la urea en dos moléculas de amoniaco. El medio lleva como indicador Rojo fenol, que se torna amarillo cuando es negativo y rosa cuando es positivo. Hay que tener precaución por que también puede ocurrir que no se produzca cambio de coloración, en este caso es negativo. el medio posee un color rosáceo (mucho menos intenso que los verdaderos positivos) lo que puede llevarnos a error (considerar falsos positivos).
Prueba de la Fenilalanina Desaminasa (PPA)
PPA - PPA +
  Determina la capacidad e la bacteria para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por acción de la enzima Fenilalanina desaminasa, esto va a producir una acidificación del medio, que se va a poner de manifiesto mediante la aplicación de 0,2 - 0,3 mL de Cloruro férrico al 10 %, si hay en el medio ác. fenilpirúvico aparece una coloración verde-azulada.
Reducción de Nitratos
Va a poner de manifiesto la capacidad de transformar los Nitratos en Nitritos. Para esto inoculamos tres tubos en el medio para dicha prueba y los incubamos 24, 49 y 72 horas respectivamente. Tras 24 h. añadimos 2 o 3 gotas del reactivo "A-B", si aparece coloración rojo cereza indica que es positivo, si no aparece coloración es un presunto negativo, para confirmarlo basta con añadir una punta de espátula de Zinc y si realmente es negativo se tornara rojo. Si el ultimo día (72 h.) la bacteria da negativo, entonces podemos decir con seguridad que no tiene capacidad para reducir los nitratos.
Positivo Presunto negativo

Movilidad
Se realiza una siembra en picadura, y tras incubar 24 h. observamos si se ha producido crecimiento entorno a la zona inoculada.
Positivo Negativo

Rojo de Metilo - Voges Proskauer
Las enterobacterias son anaerobios facultativos que usan la glucosa en dos fases: 1º Degradan la glucosa por la vía oxidativa hasta que consumen el oxigeno del medio. 2º Metabolizan la glucosa por la vía fermentativa, que puede ser de dos tipos:

- Fermentación ácido mixta: los productos finales son ácidos orgánicos, que disminuyen el pH del medio, lo que se manifiesta con el Rojo de metilo.

- Fermentación butilén-glicólica: los productos finales, como butanodiol y etanol, son neutros y producen como intermediarios acetoina, que puede detectarse con el reactivo de Voges Proskauer, el react. A que es KOH, y el B alfa-naftol, estos reaccionan con la acetoina originando coloraciones violáceas.

Para realizar el ensayo, dividimos el medio inoculado y que ha incubado tres días en dos tubos (la mitad en cada uno) y revelamos con los reactivos.

Rojo de metilo (posit. y negat.) Voges Proskauer (negativo)

Prueba de la Oxidasa y la Catalasa
Ambas pruebas se caracterizan por poder realizarse de forma inmediata a partir de nuestro cultivo problema.

La oxidasa, es una prueba que se usa para poner de manifiesto el sistema citocromoxidasa, que se encuentra en organismos aerobios, anaerobios facultativos y ocasionalmente en microaerófilos, careciendo los anaerobios estrictos de esta. El método más frecuento es el indirecto, se realiza en un trocito de papel de filtro, de forma que colocamos una gota del reactivo de Kovacs en el papel y posteriormente tomamos parte de nuestra colonia con el asa de siembra, que frotaremos sobre el papel. El resultado será positivo se se produce una reacción de color a los pocos segundos.

La catalasa, va a degradar el peroxido de oxigeno que se produce como consecuencia de la acumulación de oxigeno. Para esto en un tubo de ensayo colocamos 2 o 3 ml de peroxido de oxigeno, tomamos muestra con el asa de siembra y la introducimos en el tubo, el resultado será positivo si se observa la producción de pequeñas burbujas.

 

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