Citometría de flujo
- Características
- Ventajas
e inconvenientes de la citometria de flujo
- Estructura
básica de un citómetro de flujo
- Información
obtenida por citometría de flujo
- Técnica
CARACTERISTICAS:
La CMF es
una técnica sencilla que se aplica en la rutina diaria de muchos laboratorios
clínicos y de investigación, capaz de proporcionar resultados de forma rápida
que pueden ser aplicables al diagnostico. Gracias a su gran especificidad es
capaz de distinguir entre varias diferentes, y detectar una población celular
en una muestra en la que predominan otras poblaciones celulares mayoritarias.
Pero la principal característica de la
CMF es que puede ofrecer información simultánea de varios
parámetros de cada una de las células analizadas y la relación entre los
parámetros de una célula y los de otra célula también analizada. Permite el
análisis de dos parámetros de dispersión, SSC/FSC y tres de fluorescencia (en
equipos con un solo láser), Fl1, Fl2 y Fl3, y de una cuarta fluorescencia en
equipos con dos láseres.
VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA
CITOMETRIA DE
FLUJO
Debido a la necesidad de utilizar una suspensión de partículas
(células, núcleos, cromosomas, etc), para ser leídos de una en una hace que
se pierda información sobre la arquitectura de los tejidos que componen las
células o de las propias células, así como la ineracción entre estas y el medio
que las rodea (patrones nodulares o difusos de los linfomas). Frente a este
inconveniente la CMF
presenta múltiples ventajas frente al microscopio de fluorescencia y las
técnicas citoquímicas, como:
- Posibilidad de empleo de múltiples frente a un solo marcaje de la
citoquímica y la microscopia de fluorescencia.
- Posibilidad de analizar un elevado número de partículas en un corto período
de tiempo (5000 partículas/segundo).
- Posibilidad de cuantificar la por medio de los canales medios de
fluorescencia.
- Mayor sensibilidad y objetividad que le permiten detectar enfermedad mínima
residual y caracterizar poblaciones celulares poco abundantes en condiciones
normales como los basófilos.
- Posibilidad de analizar poblaciones celulares y epitopos celulares. -
Permite almacenar informáticamente la información del análisis para poderla
utilizar en cualquier momento y reanalizar análisis hechos con anterioridad.
- Posibilidad de cuantificar las moléculas antigénicas presentes en un grupo
celular.
ESTRUCTURA BÁSICA DE UN CITÓMETRO DE FLUJO
Esta compuesto por tres partes:
* SISTEMA FLUÍDRICO - Inyección de la muestra.
- Cámara de flujo.
* SISTEMA OPTICO - Fuentes de luz.
- Detectores
* SISTEMA ELECTRICO - Amplificador-convertidor.
- Sistema informatico
- SISTEMA FLUÍDRICO:
Este sistema consta de dos fluídos, uno que contiene en suspension a
la muestra y otro que lo envuelve a fin de darle estabilidad (sheath
fluid). Las células deben pasar una a una por delante del haz del láser.
Ambos fluídos (Solución fisiológica, PBS, aire) no se mezclan porque
circulan a diferente presión.
- SISTEMA ÓPTICO:
Este sistema se compone de dos tipos de ópticas:
- La óptica de
excitación, compuesta de el láser y las lentes apra enfocar y
dirigir el haz de luz; y
- La óptica de
lectura, compuesta por las lentes de recolección de luz emitida
luego de la interacción entre el haz del láser y las partículas y el
sistema de espejos y filtros para direccionar longitudes de onda
específicas hacia los detectores correspondientes.
- FILTROS
OPTICOS: Son aquellos que seleccionan las longitudes de onda que
deja pasar hacia el detector. Estos pueden ser:
- DE INTERFERENCIA
(Dicroicos que reflejan las long de onda no deseadas);
- DE ABSORCION
(absorben las long de onda no deseadas). De éstos hay tres tipos:
- Filtros Band Pass :
Dejan pasar un rango de longitudes de onda (Por ej: 620 – 640 nm)
- Filtros Short Pass:
Dejan pasar por debajo de una longitud de onda determinada ( Por ej:
< 575 nm)
- Filtros Long Pass:
Dejan pasar por encima de una longitud de onda determinada (Por ej: >
520 nm)
- SISTEMA
ELECTRICO: El sistema electrónico convierte todo en señales
digitales para almacenar en la computadora.
INFORMACION OBTENIDA POR CITOMETRIA DE FLUJO
Básicamente podemos obtener los siguientes datos:
- Tamaño de la célula
- Complejidad de la
membrana celular
- Con el uso de
fluorocromos se puede deterctar hasta 3 colores con un mismo laser
Señales de dispersión: La dispersión resulta de la interacción de la
luz con una partícula que produce un cambio de dirección (no de la longitud
de onda) en todas las direcciones del espacio. Las características
morfológicas que determinan la dispersión de la luz son fundamentalmente el
tamaño celular, la membrana, el núcleo y el material granular del interior de
la célula, llamado complejidad. En los Citómetros de
Flujo se miden dos fracciones de dispersión:
-La luz dispersada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la
dirección de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida
proporcional al tamaño de la partícula que produce la dispersión.
-La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es
proporcional a la complejidad de la estructura interna de la partícula.
Señales de Fluorescencia: Un fluorocromo es una molécula química
que absorbe luz a una determinada longitud de onda (energía) y emite a una
longitud superior (menor energía). El espectro de absorción o excitación es
el rango sobre el que un fluorocromo absorbe luz, y el espectro de emisión es
el rango sobre el que un fluorocromo emite luz. Cuando un fluorocromo
interacciona con la luz de excitación procedente del láser emite energía
radiante. Debido a que parte de la energía se utiliza para la absorción, la
luz emitida es de menor energía que la luz de excitación, es decir la
longitud de onda emitida es mayor. La diferencia entre la longitud de onda de
absorción y emisión se denomina Stokes shiff. Los citómetros de flujo
permiten detectar señales de fluorescencia procedentes de complejos
Antigeno/Anticuerpo marcados con un fluorocromo y situados en una célula,
siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida igual a la proporción de
la cantidad de componentes fluorescentes de la partícula.
De forma esquemática, las células teñidas entran en la cámara de flujo de
una en una y, al pasar por delante de un haz de luz de láser, emiten una luz
fluorescente y dispersada, que es separada de acuerdo a su longitud de onda por
apropiados filtros y espejos. Estas señales luminosas son recogidas por
detectores y la información se integra y analiza adecuadamente por un sistema
informático.
